Наши телефоны: 8-(863)-290-00-45 8-(863)-303-08-65 8-903-406-70-27 8-928-279-81-86
Ветеринарная клиника Вита г. Ростов-на-Дону

LAMP в диагностике дирофиляриоза собак

Карташов В.В., Карташов С.Н., Ермаков М.А., Ключников А.Г., Павлова Р.В., Миронова А.А., Калабеков М.И.
ГНУ Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт, г. Новочеркасск, Россия
ГНУ Всероссийский НИИ Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии Россельхозакадемии, г. Покров, Россия

Введение.

Дирофиляриозы – инвазионные заболевания плотоядных, вызываемые нематодами из семейства Filariidae, рода Dirofilaria. Известно два вида возбудителей: Dirofilaria immitis (паразитирует в сердце и легочной артерии собак, кошек, лисиц и волков) и Dirofilaria repens (локализуется в подкожной соединительной ткани собак и лисиц). Промежуточными хозяевами обоих видов являются комары сем. Culicidae, родов Culex, Aedes, Anopheles.

D. immitis, паразитирующие в предсердиях и желудочках сердца, нарушают правильную циркуляцию крови, вызывают расстройства сердечной деятельности, эндокардит, эмболию и тромбоз кровеносных сосудов, что приводит к гибели собак [2].

В последние годы отмечена тенденция к широкому распространению дирофиляриозов и расширению их ареала не только на юге, но и в средней полосе России. Основными причинами такого неблагополучия являются неограниченные перемещения животных из одного региона в другой, ввоз зараженных собак из других стран, ограничение использования химических средств защиты от промежуточных хозяев – комаров, а также недостаточный арсенал антгельминтиков против половозрелых дирофилярий.

Наилучшим вариантом является диагностика дирофиляриоза на ранних этапах развития инвазии. Как правило, это микроскопическая идентификация микрофилярий в нативном мазке крови, а также модифицированный метод Кнотта [1]. Однако ни один из этих методов не может исключать дирофиляриоз окончательно при небольшом количестве циркулирующих в крови личинок, поскольку эффективность такой диагностики зависит от ряда факторов (продолжительности инвазии, интенсивности микрофиляремии и др.).

Для видовой дифференциации используют специальные методы окраски микрофилярий, однако в силу сложности и трудоемкости эти методы неприменимы для рутинной диагностики. Использование полимеразной цепной реакции позволяет устранить все недостатки применяющихся на сегодняшний день методик, поскольку обладает высокой специфичностью и чувствительностью, технической простотой, в связи с чем этот метод применим для рутинных диагностических исследований.

Исследования  японских  ученых  [3] по разработке новой молекулярно-генетической  амплификационной  технологии –  loop-mediated  isothermal  amplification  (LAMP) –  показали высокую  чувствительность  и  специфичность,  многократно превышающие технологии ПЦР, а также высокую амплификационную эффективность, которая достигается при изотермальных условиях реакции. Такая технология явилась основой модифицированных методов LAMP и успешно применяется для диагностики значительного количества микроорганизмов.

Вместе  с  тем,  наиболее  важным  является  выявление   возбудителя  непосредственно  в  крови, поэтому целью исследования явилась разработка  прямого ускоренного метода выявления возбудителя заболевания в крови собак.
Задача исследования – сравнить эффективность стандартной ПЦР и LAMP в диагностике дирофиляриоза у собак.

Материалы и методы.

В качестве диагностического материала послужила кровь от 400 собак, владельцы которых обращались в ветеринарные клиники г. Ростова-на-Дону, Таганрога, Ростов-на-Дону и Новочеркасска по разным причинам.

Исследования на дирофиляриоз проводилось тремя методами: усовершенствованный метод Кнотта, методом ПЦР и LAMP. Выделение ДНК из образцов крови, молока и мазков производили набором «ДНК-Сорб B» (ФГУ ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Исследования проводили с использованием видоспецифических праймеров для D. immitis, фланкирующих участок в 420 н.п. COI гена. Образцы, которые оказались положительными на дирофиляриоз по Кнотту повторно исследовались в стандартной ПЦР и LAMP. Для проведения последней было использовано 3 пары праймеров (F3, B3, FIP, BIP, LF, BF).

Результаты исследований.

Первые результаты исследования крови по Кнотту показали наличие собак с микрофиляриемией. Наибольшая зараженность собак дирофиляриозом отмечалась в Новочеркасске – 10% (10 собак из 100). В Ростове-на-Дону, Шахтах и Таганроге этот показатель составил 3%, 3% и 2% соответственно.

В среднем зараженность собак составила 4,5%. Все позитивные пробы крови были исследованы методом ПЦР с видоспецифичными праймерами к D. immitis, в результате чего было установлено присутствие этого гельминта у 88,9% собак с микрофиляриемий (16 из 18 собак). Исследование этих проб крови в ПЦР с видоспецифичными праймерами к D. repens подтвердило наличие у остальных собак «кожной» формы дирофиляриоза.

Все положительные по дирофиляриозу пробы были исследованы с использованием LAMP-технологии.  Учитывая  отсутствие  реагентов,  используемых  японскими  коллегами,  трудности  их приобретения  и  их  высокую  стоимость,  были  проведены предварительные  эксперименты  по  оптимизации  условий реакции. Амплификацию выполняли в изотермальном режиме: 63°С – 120 минут; 80°С – 2 минуты. Визуализацию полученных ампликонов проводили после  электрофореза в 2% агарозном геле.

Полученные результаты оказались на 100% сопоставимы со стандартным вариантом ПЦР. Использование метода диагностики без использования дорогостоящих амлификаторов позволяет внедрить его в диагностическую практику ветеринарных клиник, лабораторий, школ собаководства и других учреждений специального назначения.

Заключение.

Зараженность домашних собак D.immitis и D.repens в наиболее крупных городах Ростовской области по результатам исследований составила в среднем 4% и 0,5% соответственно.

В лабораторную практику ветеринарных клиник может быть внедрен  эффективный  безаппаратный метод диагностики дирофиялриоза, основанный на изотермальной амплификационной технологии, обладающий высокой  специфичностью,  высокой  чувствительностью и позволяющий выявлять возбудителя заболевания в течение 4-5 часов от начала исследования непосредственно  в  клиническом  материале  от  собак.

Проведенные клинические  испытания  LAMP-варианта диагностики дирофиляриоза подтвердили  его  высокую  специфичность и  диагностическую  эффективность.

Литература.

  1. Бескровная Ю.В. Идентификация микрофилярий Dirofilaria spp.  с помощью ПЦР / Ю.В. Бескровная, С.А. Нагорный // Матер. докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». – вып. 9. – Москва. – 2008 . – с. 73-75.
  2. Simon F., Claudio G. Heartworm infection in human and animals. // Ediciones Universidad de Salamanca. – 2001. – 210 p.
  3. Yasuyoshi Mori, Tsugunori Notomi Loop-mediated isothermal amplifi  cation (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. – J Infect Chemother. – 2009. – №15. – p. 62–69.
    X